ترجمه مقاله بهبود تشخیص مولکولی COVID-19 از طریق آزمایش جدید، بسیار حساس و خاص رونوشت برداری معکوس PCR زمان واقعی COVID-19-RdRp/Hel

چکیده 
مواد و روش ها
نتایج
بحث
منابع

چکیده

     در 31 دسامبر 2019، سازمان بهداشت جهانی از گروهی از موارد واگیردار ناشی از علل ناشناخته در ووهان چین باخبر شد. ارزیابی های بعدی یک کرونا ویروس جدید را شناسایی کردند که در حال حاضر بر اساس بیماران تحت تاثیر قرارگرفته، سندرم شدید حاد تنفسی کرونا ویروس 2 (SARS-CoV-2) نامگذاری شده است. تشخیص های به شدت حساس و خاص آزمایشگاهی برای کنترل سریع اپیدمی بیماری کرونا ویروس مرتبط با SARS-CoV-2 (COVID-19) حائز اهمیت هستند. در این مطالعه، ما عملکرد سه آزمایش جدید رونویسی معکوس در زمان واقعی-PCR (RT-PCR) را توسعه داده و مقایسه کردیم که هدف آن RNA پلیمراز وابسته به RNA، (RdRp)/helicase (Hel), spike (S) و ژن های نوکلئوکپسید (N) SARS-CoV-2 با موارد گزارش شده در آزمون RdRp-P2 بود که در بیش از 30 آزمایشگاه اروپا مورد استفاده قرار می گیرد. در میان این سه آزمایش جدید، تست COVID-19-RdRp/Hel دارای کمترین حد شناسایی در شرایط in vitro است (1.8 از 50% بافت کشت شده از دزهای آلوده شده [TCID50]/ml با RNA ژنومی و 11.2 واکنش/کپی از RNA در رونویسی in vitro در RNA). در میان 273 نمونه حاصل از 15 بیمار که در آزمایشگاه هونگ کونگ از نظر COVID-19 تایید شدند، 77 مورد (28.2%) آن ها از نظر تست COVID-19-RdRp/Hel و RdRp-P2 مثبت بودند. تست RdRp/Hel کووید19 برای 42 نمونه دیگر RdRp-P2-negative نیز مثبت بود (119/273 (43.6%) در مقابل 77/273 (28.2%)؛ P<0.001)، شامل 120/29 (24.2%) نمونه دستگاه تنفسی و 153/13 (8.5 %) نمونه های غیر از دستگاه تنفسی بوده است. میانگین حجم ویروس در این نمونه¬ها 3.21 ×104 رونوشت RNA/ml است ( در محدوده 2.21 ×102 تا 4.71 ×105 رونوشت RNA/ml). تست COVID-19-RdRp/Hel واکنش متقابلی با سایر کروناویروس های بیماری زای انسانی و عوامل بیماری زای تنفسی در کشت سلولی و نمونه های بالینی ندارد، در حالی که بین تست RdRp-P2 و SARS-CoV در کشت سلولی واکنش متقابل وجود  دارد. تست به شدت حساس و خاص COVID-19-RdRp/Hel ممکن است به بهبود تشخیص آزمایشگاهی COVID-19 کمک کنند.

مواد و روش ها

     ویروس ها و نمونه های بالینی. SARS-CoV-2 از یک بیمار در هنگ کنگ گرفته شد که COVID-19 آن در آزمایشگاه تایید شد (22). جدایه ویروس با یک قطعه اضافی در سلول¬های VeroE6 تکثیر شد تا یک استوک کاری از ویروس ساخته شود ( 1.8 ×107 یعنی 50% کشت بافت دزهای آلوده [TCID50]/ml). برای ارزیابی اختصاصیت در شرایط in vitro، آرشیو ایزوله های کشت آزمایشگاهی (n=17) در سایر کروناویروس های  بیماریزای انسان و ویروس های تنفسی مورد استفاده از دپارتمان میکروبیولوژی دانشگاه هنگ کنگ که پیشتر توضیح داده شده به دست آمدند (23). همه پروتکل های آزمایشگاهی شامل SARS-CoV-2 زنده، SARS-CoV و MERS-CoV بودند که از روش اجرای استاندارد تایید شده در سطح 3 امکانات امنیت زیستی پیروی می کنند که پیشتر توضیح داده شد (24.25). برای ارزیابی بالینی، تعداد 273 نمونه بالینی (120 مورد از دستگاه تنفسی و 153 مورد از غیر دستگاه تنفسی) از 15 بیمار جمع آوری شد که COVID-19 آن ها در آزمایشگاه هنگ کنگ تایید شد که تست نمونه های آسپیرات/سواب، نازوفارنکس، سواب های گلو، و یا نمونه های خلط آن ها برای SARS-CoV-2 RNA از طریق آزمایش RdRp2 مثبت شد (22). علاوه بر این، عصاره نوکلئیک اسید کل در 22 نمونه ذخیره شده (ذخیره در -80 درجه تا زمان مصرف)، آسپیرات های نازوفارنکس/سواب ها و سواب-های گلو از 22 بیمار بالغ جمع آوری شدند که در بیمارستان هنگ کنگ از نظر علائم تنفسی زیاد/یا پایین مدیریت شده و این تست برای سایر عوامل بیماریزای تنفسی FilmArray RP2 مثبت بود (تشخیص BioFire، Salt Lake City, UT, USA) و بر اساس دستورالعمل کارخانه برای ارزیابی پتانسیل واکنش متقابل با سایر عوامل بیماریزای تنفسی در نمونه های بالینی مورد ارزیابی قرار گرفت. این مطالعه توسط بررسی صورت گرفته در دانشگاه هنگ کنگ/مدیریت بیمارستان تایید شد (UW 14-249). استخراج اسید نوکلئیک. عصاره نوکلئیک اسید (TNA) در نمونه های بالینی و کشت سلول آزمایشگاهی در جدایه های ویروسی با استفاده از سیستم عصاره گیری NucliSENS easyMAG (bioMérieux,Marcy-l’Étoile, France) و بر اساس دستورالعمل کارخانه که پیشتر توضیح داده شده بود، انجام شد (24). حجم نمونه های مصرفی برای استخراج و حجم رقیق سازی به نوع نمونه و مقدار نمونه موجود بستگی دارد. به طور کلی، 250 lµ از نمونه دستگاه تنفسی، نمونه ادرار، سواب روده و مدفوع تحت عصاره گیری با یک حجم رقیق شده 55 lµ قرار گرفت و 100 lµ از هر نمونه پلاسما با حجم رقیق سازی 25 lµ عصاره گیری شد. عصاره حاصل تا زمان مصرف در 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد. عصاره مشابه حاصل از هر نمونه برای همه RT-PCRها مورد استفاده قرار گرفت.

بحث

     ژنوم مثبت و تک رشته ای RNA در SARS-CoV-2 حدود 30 kb اندازه دارد و حدود 9.860 اسید آمینه را کد می کند (2، 17، 18، 27). مانند سایر بتا کروناویروس ها، ژنوم SARS-CoV-2 طوری مرتب شده است که 5=-replicase (ORF1a/b)-spike (S) واحد (E)-membrane (M)-nucleocapsid (N)-poly(A)-3= را در خود پوشانده است (17). به طور سنتی، هدف¬های ترجیحی آزمایشات RT-PCR کروناویروس شامل ژن های بیان شده حفاظت شده و/یا فراوانی مانند ژن های ساختاری S و N و غیرساختاری RdRp و ژن های چهارچوب خوانش آزاد(ORF) 1a/b هستند (16.28). برای کووید 19، پروتکل¬های تعداد آزمایشات RT-PCR مورد استفاده توسط موسسات مختلف به صورت آنلاین در سایت زیر در دسترس است (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus2019/technical-guidance/laboratory-guidance). هدف این آزمایش های ORF1a/b، ORF1bnsp14, RdRp، ژن-های S، E یا N موجود در SARS-CoV-2 است و برخی آزمایش های غیر اختصاصی هستند که SARS-CoV-2 و سایر بتاکروناویروس ها مانند SARS-CoV را شناسایی می کنند (20.29).