چکیده
مقدمه
مواد و روشها
جمع آوری شفیره های سایپریس و شفیره های جوان از میدان یا پرورش شفیره سایپریس
نشست
رنگ آمیزی
ریزبینی دوکانونی
سنجش کمّی باکتری ها
نتایج
باکتری ها در سطح مشترک
سرخاب های مرحله 1 و مرحله 2 – اتصال اولیه و نشست
سرخاب های مراحل 3-5 – تغییرات اساسی از لحاظ شکل
سرخاب های مرحله 6 – شفیره های جوان با دگردیسی کامل
سرخاب روزهای 3-5 و روزهای 6-7 – شفیره های جوان بعد از دگردیسی
ماده جدید در سطح مشترک
الگوهای زنده/مرده باکتریها در سطح مشترک
رنگ آمیزی پروتئین
رنگ آمیزی ROS
بحث
منابع
چکیده
شفیره سرخاب سایپریس متحرک (نام گروهی از جانوران بندپا) نشست (سکونت گزینی) و دگردیسی را انجام می دهد، و به حشره جوان غیرمتحرک تغییر می کند به طوری که از لحاظ ریخت شناسی و رشد، شبیه یک حشره بالغ (بزرگسال) می گردد. چون بیوفیلم ها روی سطوح غوطه ور شده ای باقی می مانند که به آن می چسبند، بنابراین سرخاب ها (کشتی چسب ها) در طی اتصال و رشد متعاقب باید با باکتری ها تعامل داشته باشند. هدف مطالعه حاضر این بود که خصوصیات سطح مشترک در حال توسعه برای سرخاب و زیرلایه آن را در طی تغییر رشدی کلیدی آن توصیف کند تا مکانیزم های بالقوه ای را توضیح دهد که سبب ترویج اتصال آن می گردند. ما این سطح مشترک را با استفاده از ریزبینی دوکانونی و رنگینه های فلورسنت توصیف کردیم تا تغییرات ریخت شناختی و شیمیایی در سطح مشترک و وضعیت باکتری های حاضر را به عنوان یک مرحله رشدی سرخاب شناسایی نماییم. در فرآیند رنگ آمیزی، مواد وصله مانندی ظاهر شدند که حاوی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک، گونه های باز فعال اکسیژن در بین کوتیکول در حال توسعه، و تغییرات در زیست پذیری باکتری ها در «سطح مشترک در حال توسعه» بودند. ما پی بردیم که سرخاب زمانی که از سایپرید به مرحله جوانی دگردیسی پیدا میکند، مواد پروتئین دار با ظاهر مایع لخته شده، در داخل یک سطح مشترک منتشر شدند و در آنجا باقی ماندند. این مواد لکه های مثبتی از پروتئین – از جمله فسفو پروتئین و اسیدهای نوکلئیک – پیدا کردند. نواحی کوتیکول در حال توسعه و خود مواد وصله ای برای گونه های باز فعال اکسیژن، لکه دار شدند. باکتری ها غایب بودند تا اینکه سایپرید یک اتصال محکم پیدا کرد اما با پیشروی توسعه سرخاب، جمعیت های آنها مردند. محیط اکسایشی میتواند به سيتوتوکسيسيته مشاهده شده برای باکتری ها کمک کند و پتانسیل ایجاد اتصال عرضی اکسایشی را برای مواد کوتیکول و پروتئین دار را در سطح مشترک دارا می باشد.
مواد و روشها
جمع آوری شفیره های سایپریس و شفیره های جوان از میدان یا پرورش شفیره سایپریس
داروین در سال 1854 از شفیره های Amphibalanus (=Balanus) amphitrite استفاده کرد که یا در آزمایشگاه پرورش داده شده بودند و یا از پلانکتون در آزمایشگاه دریایی دانشگاه دوک در بیوفورت (ایالت کارولینای شمالی، ایالات متحده) جمع آوری شده بودند. ناپلیوس ها از شفیره های بالغ جمع آوری شده از میدان منتشر شده بودند؛ این شفیره ها با تکنیک های کشت پرورش داده شده بودند (ریت اسکاف و همکارانش 1984، 1992، 2008؛ هلم 1990). سایپریدها برای مقایسه با جانورانی از میدان، از پلانکتون های جمع آوری شده از حوضچه های آزمایشگاه دریایی دوک با استفاده از یک مش پلانکتون 64 میکرومتری (64 μm) در ژوئن 2013 طبقه بندی شده بودند. برای جمع آوری شفیره های جوان از میدان، لامل ها را به خط کش های پلاستیکی با نوارهای لاستیکی تمیز وصل کردیم و خط کش ها را با کش زیپ دار به لوله های PVC از یک حوضچه شناور مهار کردیم که حدود 30 سانتیمتر آن زیر سطح آب بود. ما این خط کش ها را به صورت روزانه بررسی می کردیم تا از نشست سرخاب ها آگاه شویم؛ ما چهار شفیره جوان را جمع آوری و برای مقایسه با شفیره های جوان پرورشی (پرورش داده شده در آزمایشگاه) طبق توضیحات زیر آماده کردیم. برای اغلب آزمایشات، سایپریدهای کشت شده را مورد استفاده قرار دادیم و آنها را در آزمایشگاه آماده نمودیم.
ریزبینی دوکانونی
ریزبینی اسکن لیزری دوکانونی را طبق توضیحات قبلی اجرا نمودیم (گوهاد و همکارانش 2009، 2012، 2014؛ آلدرید و همکارانش 2013). اغلب تصاویر با استفاده از ریزبینی اسکن لیزری دوکانونی معکوس Zeiss LSM 780 در دانشگاه دوک گرفته شدند، که به خطوط لیزری 405, 458, 488, 514 و 633 nm مجهز بود. عکسبرداری های بیشتر را با استفاده از یک سیستم عکسبرداری دوکانونی Nikon C1si Spectral در آزمایشگاه تحقیقات نیروی دریایی ایالات متحده و یک ریزبینی معکوس Nikon Ti-E مجهز به یک سیستم عکسبرداری دوکانونی طیفی Nikon Clsi در دانشگاه کلمسون انجام دادیم. برای اغلب پردازش عکس ها از FIJI (ImageJ)، و از نرم افزار تحلیل عکس Imaris (نرم افزار علمی Bitplane) در تأسیسات اصلی ریزبینی نوری دانشگاه دوک استفاده کردیم. از تمام خصوصیات تولیدکننده برای برانگیزش و انتشار طول امواج برای رنگینه های فلورسنت، به استثنای SYPRO Ruby مورد استفاده قرار گرفت و مشخص شد که مقدار اوج برانگیزش نوری اختصاصی 460 nm غیرمؤثر و یک 405 nm برانگیزش در این کاربرد مؤثر بود. قدرت لیزری و تنظیمات بهره را نیز در دامنه های سازگاری برای تمام مجموعه رنگینه ها تنظیم کردیم اما در صورت لزوم تعدیل هایی را نیز انجام دادیم تا سیگنال را با نسبت های نویز – به منظور شناسایی – بهینه سازیم.