چکیده

مقدمه

مواد و روش کار

تهیه نانوحباب‌ها

ساخت مدل‌های کشت سلولی تحت برون‌تنی و مدل‌های حیوانی زنوگرافت تومور

تصویربرداری و نفوذ توانایی نانوحباب‌ها در موش‌های نود

سنتز و ویژگی آپتامر A10-3.2

تهیه و آزمایش درستی نانوحباب‌های هدفمند

اعتبارسنجی ظرفیت هدفمندی نانوحباب‌ها در سطح سلولی در شرایط برون تنی

تصویربرداری سونوگرافی و تصویربرداری فلورسانس جانداران کوچک در موش‌های متحمل تومور

تشخیص بیان PSMA در تومورهای زنوگرافت

تجزیه‌وتحلیل آماری

نتایج

CDFI و تراوایی نانوحباب‌ها در موش‌ها

سنجش درستی ویژگی آپتامر

شناسایی و خصوصیات نانوحباب‌های هدفمند

سنجش درستی ترکیب‌شوندگی میان نانوحباب‌های هدفمند و سلول‌ها در شرایط برون تنی

CEUS و تصویربرداری فلورسانس دورن تنی در تومورهای زنوگرافت

بحث

نتیجه‌گیری

منابع

چکیده

در این مطالعه نانوحباب هدفمند لیپیدی حامل آپتامر A10-3.2 ضد آنتی‌ژن اختصاصی غشایی پروستات ساخته شد و تأثیر آن در تصویربرداری سونوگرافی سرطان پروستات بررسی شد. موادی که برای نوسان مکانیکی استفاده شد، عبارتند از: 2-دی پالمیتول-سن-گلیسرو-3- فسفوکولین، 1,2- دی پالمیتول-سن-گلیسرو -3-فسفاتیدیک اسید، 1,2- دی پالمیتول-سن-گلیسرو-3-فسفواتانولامین، 1,2-دی پالمیتول-سن-گلیسرو-3- فسفوگلیسرول، کربوکسیل دستکاری شده 1,2-دی استریول- سن- گلیسرو-3- فسفواتانولامین و پلی اتیلن گلیکول-2000 و نانو حباب‌ها از طریق روش سانتریفیوژ شناوری تهیه شدند. پس از این نانوحباب‌ها به موش‌ها تزریق شد که تصویربرداری رنگی داپلر جریان خون شکم بطور چشمگیری بهبود یافت. با وجود تزریق نرمال سالین به بطن چپ به منظور تخلیه نانوحباب‌های موجود در خون، نانوحباب‌ها در بخش‌های بافت توموری باقی مانند که مشخص کرد نانوحباب‌ها می‌توانند از طریق نفوذپذیری و اثر احتباس به فضاهای بافتی وارد شوند. آپتامرهای A10-3.2 ترکیب شده با فلوئور که از طریق سنتز شیمیایی بدست آمدند، برای سلول‌های PSMA مثبت ویژگی مناسبی را نشان دادند و این آپتامرها به منظور ایجاد نانوحباب‌های هدفمند، از طریق واکنش آمید به مولکول‌های لیپیدی کربوکسیل دستکاری شده 1,2-دی استریول- سن- گلیسرو-3- فسفواتانولامین روی پوسته بیرونی نانوحباب‌ها متصل شدند. الکتروفورز ژل و ایمونوفلورسانس تأیید کردند که نانوحباب‌های هدفمند بطور موفقیت آمیز ساخته شدند. در مرحله بعد، با استفاده از آزمایشات ترکیب‌شوندگی برون تنی و فلوسایتومتری در سطح سلولی نانوحباب‌های هدفمند توانستند با سلول‌های PMSA مثبت (سلول‌هایC4-2) ترکیب شوند در حالیکه با سلول‌های PMSA منفی (سلول‌هایPC-3) ترکیب نشدند. در نهایت، برای مشاهده تغییرات پارامترهای نانوحباب‌های هدفمندو غیرهدفمند در حالت سونوگرافی کنتراست بهبودیافته و توزیع نانوحباب‌های هدفمند رنگ‌آمیزی شده با Cy5.5 در تصویربرداری فلورسانس جانداران کوچک از زنوگرافت‌های C4-2 و PC-3 در موش‌ها استفاده شد. مقایسه شاخص‌های سونوگرافی میان نانوحباب‌های هدفمند و غیر هدفمند در زنوگرافت‌های C4-2 نشان دادند که نانوحباب‌ها زمان‌های اوج مشابهی داشتند (p>0.05) در حالیکه شدت اوج، نیمه زمان شدت اوج و سطح زیر منحنی 1/2 شدت اوج اختلاف معناداری داشتند (p<0.05). در زنوگرافت‌های PC-3، این چهار شاخص هیچگونه اختلافی را نشان ندادند. تصویربرداری فلورسنت توانایی تجمع نانوحباب‌های هدفمند را در تومورهای زنوگرافت C4-2 نشان داد. در نتیجه، نانوحباب‌های هدفمند حامل آپتامر A10-3.2 ضد PSMA در سرطان پروستات اثر تصویربرداری مشخص و هدفمندی دارند.

مواد و روش کار

تهیه نانوحباب‌ها

اجزاء لیپیدی شامل 2-دی پالمیتول-سن-گلیسرو-3- فسفوکولین (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL ، آمریکا)، 1,2-دی پالمیتول-سن-گلیسرو -3-فسفاتیدیک اسید(Corden Pharma, Liestal, ، سویس)، 1,2- دی پالمیتول-سن-گلیسرو-3-فسفواتانولامین(Corden Pharma)، 1,2-دی پالمیتول-سن-گلیسرو-3- فسفوگلیسرول (Corden Pharma)، کربوکسیل دستکاری شده 1,2-دی استریول- سن- گلیسرو-3- فسفواتانولامین (DSPE-PEG2000-COOH; NANOCS, Boston, MA, USA)و پلی اتیلن گلیکول-2000 (PEG-2000) در نسبت معینی از محلول آبی حاوی گلیسرین: محلول نمک فسفات با خاصیت بافری (PBS) در(v/v) 1:9 حل شدند و در طول شب روی تکان دهنده افقی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در داخل دستگاه انکوباتور قرار داده شدند. این محلول در روز بعد داخل یک بطری حاوی پنی سیلین ریخته شد و هوای بالای بطری حاوی پنی سیلین تخلیه و به جای آن پرفلوئورپروپان (C_3 F_3) (انیستیتو پژوهشی مهندسی فیزیک و شیمی صنعت هسته‌ای، تایجین، جمهوری خلق چین) تزریق شد. این روش با استفاده از روش نوسان مکانیکی با حرکت دو طرفه افقی با فرکانس عملکردی بزرگتر از rpm 4500 به مدت 80 ثانیه با استفاده از آمالگاماتور سری ST-B (شرکت AT&M Biomaterials، بیجینگ، جمهوری خلق چین) تکان داده شد. برای جداسازی مواد لیپیدی که در نانوحباب‌ها و میکروحباب‌ها در لایه بالایی گیر نیفتاده بودند، سوسپانسیون بدست آمده بطور مرتب هر سه دقیقه در 300× g و 300 rpm سانتریفیوژ شد. در طول تهیه نانوحباب‌های حامل رنگ‌آمیزی Dil (Beyotime Institute of Biotechnology، شانگهای، جمهوری خلق چین)، میزان مشخصی از ماده رنگ‌آمیزی Dil به محلول آبی افزوده شد. سایر مراحل مشابه تهیه نانوحباب‌ها بودند.

ساخت مدل‌های کشت سلولی تحت برون‌تنی و مدل‌های حیوانی زنوگرافت تومور

سلول‌های سرطانی پروستات PC-3 شرکت Type Cul¬ture Collection آمریکا (ATCC, Manassas, VA, USA) و سلول‌های سرطانی پروستات C4-2 آزمایشگاه‌های ViroMed در جان هاپکینز در محیط کشت RPMI 1640 استرپتومایسین در 〖CO〗_2 پنج درصد و دمای 37 درجه سانتی‌گراد درون انکوباتور کشت داده شدند که این محیط کشت از سرم جنین گاو 10% و پنی‌سیلین 1% تهیه شده بود. در طول پیوند زیرجلدی تومورهای زنوگرافت حیوانی، 200 μL از سلول‌های توموری در فاز رشد تصاعدی در غلظت 2.5×10^7/mL و 200 μL از ماتریژل BD (BD Biosciences, San Jose, CA, ، ایالات متحده آمریکا) مخلوط شدند و از راه زیرجلدی به موش‌های نود BALB/c-nu با عمر 4 تا 5 هفته (کمپانی HFK Bioscience، بیجینگ، جمهوری خلق چین) تزریق شد. این موش‌ها بطور مداوم در یک محیط پاکیزه نگهداری شدند. تمام آزمایشات انجام شده در این مطالعه از طرف کمیته اخلاق حیوان سومین دانشگاه پزشکی نظامی تأیید شدند که مطابق با اصول راهنمای بین‌المللی پژوهش‌های زیست‌پزشکی حیوانی سال 1985 انجام شدند.